核酸纯化,trizol

rna 提取操作图示

    通常,总rna 提取试剂在提取过程中无法完全避免dna 的污染,在大多数pcr 扩增过程中其影响不是很大,如果要进行严格的mrna 表达量分析,我们建议在进行模板和引物的选择时：选用跨内含子的引物,以穿过mrna中的连接区,这样dna就不能作为模板参与扩增反应;选择基因组dna 和cdna 上扩增的产物大小不一样的引物对;将rna 提取物用rnase-free 的dnase i 处理,具体操作步骤如下：
    1. 取不含rnase 的离心管：
􀂃      15μg 的rna 提取物
􀂃       1μl 的 10xdnase buffer
􀂃       1u 的dnase i (rnase-free)
              用depc 处理的水定容至10μl
    2. 室温孵育15 min;
    3. 在反应液中加入1μl 的20mm edta（不含rnase）,65℃放置10 分钟。

rna的得率与纯度

1. 分光光度的定量分析：

    od230、260、280、320下的吸光度分别代表了盐浓度、核酸、蛋白等有机物、背景（溶液浑浊度）的值。一般的，我们只看od260/od280（ratio,r)，1.8＜r＜2.0时，我们认为rna中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，录你用tris作为缓冲液检测吸光度时，r值可能会大于2（一般就是＜2.2）。当r＜1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显；当r＞2.2时说明rna已经水解成单苷核酸了。

• 取一定量的 rna 提取物,用25mm tris-hcl（ph7.5）稀释n 倍,作分光光度测定；

• 用tris-hcl 将分光光度计调零；

• 取100μl 稀释液进行测定,测的od260,od280 进行接下来的浓度及得率的计算；
       终浓度 = (od260)×(稀释倍数n)×40ug/ml

     od比值＝(od260)∶（od280)×稀释倍数n)
􀃖      注意： od260 测得值范围： 1.2 <od260<0.05（在使用的rnase-free 的纯水进行溶解剂稀释,测出的结果较低）

2. rna的电泳

    一般情况下，rna的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我们的经验，如果你仅仅是为了检测rna的质量没有必要进行甲醛变形电泳，用普通的琼脂糖胶就可以了。如果28s和18s条带明亮、清晰、条带锐利，并且28s的亮度在18s条带约两倍以上，我们认为rna的质量是好的。

rna电泳图                       与trizol试剂提取对比电泳图

总rna的保温实验

• 按照样品浓度，抽提出两份1000ng样品的体积，加入至0.5ml的离心管中，密闭管盖，一份放置在塑料浮板的适当孔位上，放入70℃的恒温水浴中，保温1小时，取出离心管，另一份放置在-20℃冰箱中保存。

• 保温实验后，在离心管中各加入8ul的tris-hcl再加入溴酚兰2ml，进行电泳；

• 经过电泳后，进行拍摄，记录电泳条带；

rna质量判定标准

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